Ilona Domaga 322 a, studia, III rok, wyklady, ebook, pdf

Ilona Domagała
Biotechnologia rok III

Metody tworzenia genetycznie zmodyfikowanych zwierząt.

Modyfikacje, jakim podlegają organizmy można podzielić na trzy grupy

· zmieniona zostaje aktywność genów naturalnie występujących w danym organizmie

· do organizmu wprowadzone zostają dodatkowe kopie jego własnych genów

· wprowadzany gen pochodzi z organizmu innego gatunku (organizmy transgeniczne)

Transformacja genetyczna - wprowadzenie do komórki obcego materiału genetycznego (DNA), zwłaszcza niewielkiej jego porcji, obejmującej jeden do kilku genów. Zmodyfikowana w ten sposób komórka oraz - w przypadku organizmów wielokomórkowych - zregenerowany z niej organizm nosi nazwę transformanta. Transgen- gen wprowadzony na zasadzie transformacji do komórki-biorcy.

Transformant i jego potomstwo dziedziczące transgeny nazywa się organizmami transgenicznymi albo zgodnie z przyjętym obyczajem, choć nie całkiem zgodnie z logiką, organizmami genetycznie zmodyfikowanymi, czyli GMO. Otrzymywanie transformantów, czyli transformacja genetyczna jest istotą inżynierii genetycznej.

Czym są zwierzęta transgeniczne ?

Są to zwierzęta , do genomu których wprowadzono nowy gen , heterologiczny (z innego organizmu) w taki sposób , aby znalazł się on zarówno w komórkach somatycznych jak i komórkach pasma płciowego dzięki czemu podlega dziedziczeniu. Jest to trwała modyfikacja genetyczna. Technika uzyskiwania takich organizmów różni się w zależności od tego czy mamy do czynienia z rośliną czy zwierzęciem. Wyróżniamy następujące metody wprowadzania egzogennego DNA do komórek zwierząt:

· przypadkowe wbudowanie fragmentu liniowego DNA

· modyfikacja własnego genomu w wyniku wprowadzenia obcego DNA (technologia knock out i knock in

· insercja całego sztucznego obiektu genetycznego np. sztucznego chromosomu bakteryjnego BAC ( Bacterial Artificial Chromosome) lub sztucznego chromosomu drożdżowego YAC (Yeast Artificial Chromosome).

Sztuczne chromosomy drożdżowe (yeast artificial chromosome)- YAC- służą do klonowania bardzo dużych fragmentów DNA (do 5 mln pz). Są wykorzystywane do ustalania map fizycznych dużych chromosomów wyższych Eucaryota.

Sztuczne chromosomy bakteryjne ( bacterial artificial chromosome)- BAC- wektory oparte na plazmidach znajdujących się w naturalnych warunkach w E. coli.

Sztuczne chromosomy ssaków ( mammalian artificial chromosome)- MAC- zawierają podstawowe regiony chromosomu ludzkiego i mysiego.

Sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych

Wyróżniamy kilka metod, które wykorzystujemy do procesu transgenizacji zwierząt hodowlanych oraz labolatoryjnych:

· transfer wirusowy DNA

· mikroiniekcja DNA do zygoty

· transplantacja jąder komórkowych

· modyfikacja pierwotnych komórek zarodkowych ES.

TRANSFER WIRUSOWY DNA - metoda ta bazuje na infekcji przy pomocy retrowirusów oraz lentiwirusów. Główną przewagą tej metody nad pozostałymi jest wyjątkowo duża wydajność sięgająca nawet 80% transgenicznego potomstwa. Ponadto retrowirusy i lentiwirusy mają zdolność do integracji z genomem gospodarza po wniknięciu do jego komórki. W przypadku retrowirusów ograniczeniem metody stało się wyciszenie ekspresji genów ( obecnych w sekwencji wbudowanego do genomu gospodarza) podczas rozwoju zarodka. Prawdopodobnie wady tej pozbawione są lentiwirusy które stanowią jedną z klas retrowirusów. Lentiwirusy są zdolne do infekcji zarówno dzielących i jak i nie dzielących się komórek i ta cecha sprawiła, że są szeroko stosowane jako wektory w terapiach genowych. Do otrzymania zwierząt transgenicznych z zastosowaniem lentiwirusów wykorzystano dwie metody: infekcje jednokomórkowych zarodków oraz infekcje pierwotnych komórek zarodkowych ES .

MIKROINIEKCJA DNA DO ZYGOTY - metoda ta opiera się na mikroiniekcji DNA (w postaci sztucznych chromosomów lub liniowego) do jednego z przedjądrzy jednokomórkowego zarodka - zygoty używając do tego procesu mikrochirurgicznej szklanej pipety. Przedjądrza mają tą cechę, że zawierają materiał genetyczny pochodzący zarówno od ojca jak i od matki tuż przed połączeniem się w jedno jądro komórkowe, które w późniejszym okresie kieruje prawidłowym rozwojem zarodka.

Do dowolnie wybranego przedjądrza wstrzykiwany jest roztwór DNA, po czym nastrzyknięte zygoty hoduje się in vitro aż do osiągnięcia stadium dwukomórkowego. Minusem tego etapu jest brak możliwości dokładnego kontrolowania objętości wstrzykiwanego roztworu DNA.

Proces mikroiniekcji DNA daje szanse przeżycia tylko połowie zarodków, które następnie umieszczane są w jajowodach samic - matek zastępczych. Po około trwającej 3 tygodnie ciąży u gryzoni rodzi się około 30% przetransformowanych zarodków wśród których około 15% posiada w swoim genomie zintegrowany transgen.

Metoda mikroiniekcji opiera się na przypadkowej integracji wstrzykniętego transgenu z genomem gospodarza i nie ma możliwości wyboru lokalizacji takiej integracji. Ponadto nie ma możliwości kontroli liczby kopii transgenu wbudowanego w genom, które często układają się tandemowo.

Uzyskany transgeniczny osobnik może posiadać badany transgen we wszystkich komórkach swojego organizmu lub może być chimerą. Chimera z definicji to taki organizm, którego komórki ciała nie są identyczne pod względem genetycznym. W przypadku zwierząt oznacza to, że niektóre komórki posiadają transgen a inne nie. Taka sytuacja może się zdarzyć, gdy integracja transgenu do genomu nastąpiła po pierwszym podziale komórkowymi tylko w jednej linii komórek potomnych zwanych blastomerami. W sytuacji kiedy transgen nie znajduje się w komórkach płciowych założycielskiego osobnika transgenicznego, wtedy nie będzie on przekazywany następnym pokoleniom, co uniemożliwi wyprowadzenie linii transgenicznej oraz przeprowadzenie badań. Jedną z najważniejszych zalet metody mikroiniekcji DNA jest brak ograniczenia rozmiaru wstrzykiwanego DNA.

Dokonuje się iniekcji DNA pochodzącego z plazmidów (ok.10 kpz), kosmidów (ok. 45 kpz), a także DNA ze sztucznych chromosomów BAC, YAC.

MODYFIKACJA PIERWOTNYCH KOMÓREK ZARODKOWYCH ES

Metoda otrzymywania zwierząt transgenicznych z wykorzystaniem pierwotnych komórek zarodkowych ES (ang. embryo stem cells) pozwala na precyzyjną modyfikację badanego genu lub miejsca w genomie. Komórki ES izolowane są z blastocysty (wczesny etap rozwoju zarodka), dzięki czemu otrzymuje się komórki niezróżnicowane, które posiadają zdolność wbudowywania się do tkanek rozwijającego się zarodka po ponownym wprowadzeniu do blastocysty.

W metodzie tej komórki ES modyfikowane są in vitro w bardzo precyzyjny sposób. Podstawową techniką wprowadzania genów do komórek ES jest elektroporacja, ale także wykorzystuje się lipofekcję oraz metodę wapniową. Aby uzyskać pożądane miejsce integracji wprowadzany fragment DNA zawiera sekwencję genu selekcyjnego otoczoną przez sekwencje homologiczne do modyfikowanego genu. W jądrze komórki następuje rozpoznanie sekwencji otaczających i wymiana genomowej sekwencji na sekwencję wprowadzaną przez badacza. Wprowadzenie „obcego DNA” wyłącza prawidłowe funkcjonowanie tego genu w komórce, dzięki czemu uzyskuje się komórkę z wyłączonym genem tzw. knock-out. Ekspresja genu selekcyjnego (znajdująca się na wprowadzonym DNA) pozwala wybrać tylko te komórki-klony, w których nastąpiła właściwa wymiana (homologiczna rekombinacja).

Komórkę, w której nastąpiła wymiana i wyłączenie interesującego nas genu namnaża się w odpowiednich warunkach selekcyjnych. Komórki potomne następnie transferuje się do blastocysty, w której zmodyfikowane komórki ES łączą się z niezmodyfikowanymi komórkami zarodka tworząc jeden organizm. Otrzymana chimera posiada część komórek ze zmienionym genotypem, czyli z wyłączonym genem – knock -out. Jeżeli komórki ES- knock -out zasiedlą tzw. sznury płciowe, czyli komórki z których w życiu dorosłym powstaną komórki rozrodcze, to taki osobnik będzie mógł przekazać nową cechę - knock- out genu następnemu pokoleniu. Potomstwo osobników chimerowych jest heterozygotyczne i dopiero po skrzyżowaniu dwóch heterozygot można otrzymać osobnika homozygotycznego z całkowicie wyłączonym genem (knock-out) na obu chromosomach homologicznych. Opisane wyłączanie genów stosuje się w celu zbadania funkcji danego genu, poprzez analizę nieprawidłowości powstałych u homozygotycznych osobników typu knock-out.

TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH - jest to jedyna metoda pozwalająca na uzyskanie klonów liczących większą liczbę osobników.

Wcześniej opisana metoda możliwa jest do zastosowania jedynie u myszy, natomiast dla pozostałych gatunków istnieje inna droga otrzymywania osobników z wyłączonym genem typu knock-out. Wykorzystuje ona technikę transplantacji jąder komórkowych (określana jako klonowanie somatyczne). W metodzie tej można wykorzystać wiele rodzajów komórek somatycznych, które w hodowli mogą być modyfikowane w podobny sposób jak mysie komórki ES. Po otrzymaniu komórek zmodyfikowanych np. typu knock-out, jedną z nich umieszcza się w pobliżu oocytu, z którego wcześniej mikrochirurgicznie usunięto jądro komórkowe. Następnie łączy się obie komórki w procesie elektrofuzji, poddając je działaniu pola elektrycznego. W ten sposób otrzymujemy jednokomórkowy zarodek, którego rozwój kierowany jest na początku przez składniki zawarte w cytoplazmie oocytu, a następnie funkcję rozwoju przejmuje jądro komórki somatycznej. Jeżeli komórka ta została wcześniej zmodyfikowana np. poprzez knock- out genu, zmiana ta obecna będzie w każdej komórce powstałego organizmu.

Podsumowanie

Pierwsze dwie metody wykorzystywane są do otrzymywania zwierząt głównie z nadekspresją określonych konstrukcji genetycznych. Natomiast technologia ES pozwala na wyłączenie wybranego genu tzw. „knock-out”. Jak dotąd technikę delecji genów można było zastosować jedynie u myszy. Alternatywną metodą tworzenia zwierząt typu „knock-out” dla innych gatunków jest technika transplantacji jąder komórkowych.

Obecnie intensywnie rozwijane są metody indukowalnej/warunkowej ekspresji genów. Spowodowane jest to potrzebą uzyskania zwierząt, w których ekspresja lub „knock-out” wybranego genu obecne są tylko w określonych komórkach ciała lub w czasie zależnym od badacza. Głównymi systemami tego typu są: system Cre/lox – umożliwiający „knock-out” genu ograniczony tylko do pewnego typu komórek oraz system tetracyklinowy – umożliwiający włączanie i wyłączanie ekspresji wprowadzanego genu w dowolnym czasie.

Źródła:

o Biotechnologia i inżynieria genetyczna; http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/biotech/biotech7.html

o Magdalena Górska, Marek L. Kowalski- Knock- out genowy- zastosowanie w badaniach medycznych; http://www.mediton.pl/library/aai_volume-2_issue-3_article-245.pdf

o Witold Konopka- Zwierzęta transgeniczne w neurobiologii; http://www.ptbun.org.pl/archiv/nmwn04_konopka.pdf

o Daniel Machnio- Metody otrzymywania zwierząt transgenicznych; http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Machnio06

[ Pobierz całość w formacie PDF ]

Wątki